多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞（PC）惡性腫瘤，通常以一種良性病癥開(kāi)始，稱(chēng)為意義不明的單克隆性丙種球蛋白?。∕GUS），并可隨著時(shí)間推移過(guò)渡到明顯的漿細(xì)胞白血病和髓外骨髓瘤。該病的特征包括血鈣濃度升高、腎衰、貧血、免疫功能受損和溶骨性骨病變。多發(fā)性骨髓瘤約占所有癌癥的1%，占所有血液學(xué)惡性腫瘤的10%。個(gè)人有 MGUS 病史則是發(fā)展為MM的一個(gè)周知的風(fēng)險(xiǎn)因素，每年轉(zhuǎn)化為MM的風(fēng)險(xiǎn)為1%。

為了解MM 的生物學(xué)和臨床方面而進(jìn)行的日益全面的研究工作，促進(jìn)了新的方案、藥物和治療方法的發(fā)展，從而顯著提高了全部緩解（CR）率。因此，需要有更好的策略來(lái)檢測(cè)和定義低水平的疾病，并預(yù)測(cè)長(zhǎng)期結(jié)果。治療期間未被清除的殘留腫瘤性 PC（也稱(chēng)為可測(cè)量的殘留病，MRD）的數(shù)量可能比例很低，從而不容易被形態(tài)學(xué)或其它常規(guī)技術(shù)發(fā)現(xiàn)。為了更好地對(duì)患者進(jìn)行分層，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了分子和流式細(xì)胞檢測(cè) MRD 的方法，檢測(cè)靈敏度為0.001%-0.0001%。

MM患者M(jìn)RD評(píng)估的臨床意義早有報(bào)道，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（MFC）MRD 陰性已被認(rèn)定為預(yù)測(cè)長(zhǎng)期良好結(jié)果的有力指標(biāo)。MFC被證明具有更高的適用性（適用于>95%的患者）、更廣泛的可用性、更簡(jiǎn)單的儀器設(shè)置、更短的報(bào)告時(shí)間（<6 小時(shí)）、更好的可重復(fù)性，并允許定量評(píng)估抗原表達(dá)水平以進(jìn)行表型分析。

為了可靠地應(yīng)用流式方法來(lái)評(píng)估極低含量的骨髓瘤細(xì)胞，方法開(kāi)發(fā)需要考慮以下多種因素來(lái)保證檢測(cè)準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度：

a.骨髓采集量

b. 治療后 MRD 評(píng)估的最佳時(shí)間點(diǎn)

c. 疾病的局灶性

d. 骨髓樣本的運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件

e. 用于識(shí)別正常與異常 PC 的抗體克隆選擇

f. 既往用過(guò)抗體藥物的免疫療法

g. 骨髓細(xì)胞前處理方法

h. 獲取數(shù)百萬(wàn)事件的方案條件優(yōu)化

i. 數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀策略

在這里，我們重點(diǎn)討論標(biāo)本采集、樣品處理、方案設(shè)計(jì)、抗體克隆的選擇、質(zhì)量控制和建立 LOD 和 LLOQ 的方法。

PART 1 · 樣品儲(chǔ)存和質(zhì)量 ·

由于PC通常存在于骨髓中，骨髓是用于評(píng)估MM MRD的主要標(biāo)本來(lái)源。外周血也被認(rèn)為是評(píng)估 PC 疾病的合適標(biāo)本，盡管它在 MM MRD 中的作用還有待確定。一般認(rèn)為，與其他細(xì)胞學(xué)方法相比，流式細(xì)胞術(shù)會(huì)低估骨髓中PC的比例。Rawstron 等人在他們的研究中證實(shí)了這一觀(guān)點(diǎn)，他們還明確指出，第一次抽吸的樣本中PC的濃度最高，以后每次抽吸都會(huì)明顯下降。雖然通過(guò)MFC 檢測(cè)對(duì)明顯復(fù)發(fā)的MM MRD 樣本的臨床解釋不可能因?yàn)檠合♂尪淖儯珜?duì)于含有極低比例異常漿細(xì)胞的 MRD+樣本，這種稀釋可能會(huì)引起假陰性。因?yàn)楦叨却硇缘墓撬铇?biāo)本對(duì)于有效和精確的結(jié)果至關(guān)重要，為了避免由于過(guò)度的外周血稀釋造成的采樣偏差，第一次抽吸的骨髓應(yīng)始終用于MRD 評(píng)估。

遺憾的是，第一次抽出的骨髓經(jīng)常留給形態(tài)學(xué)或其他病理學(xué)檢查，因此，流式細(xì)胞室往往只能得到次優(yōu)標(biāo)本。ó skarsson JT 等人研究出了一種名為骨髓質(zhì)量指數(shù)（BMQI）的新方法來(lái)評(píng)估骨髓標(biāo)本采樣質(zhì)量，通過(guò)比較第一次和第二次抽取的骨髓，他們發(fā)現(xiàn)有核紅細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞最能預(yù)測(cè)稀釋程度。與第二次相比，第一次采樣的標(biāo)本中這些細(xì)胞的比例更高。

需要注意的是，吸出的骨髓細(xì)胞可以用 EDTA 或肝素鈉真空管收集，但由于儲(chǔ)存在肝素中時(shí) CD138 信號(hào)會(huì)減弱，所以 EDTA 比肝素鈉更受歡迎。ACD 不得用于骨髓標(biāo)本抗凝，因?yàn)闃?biāo)本與抗凝劑的比例不是最佳的，會(huì)改變PH 值，從而降低細(xì)胞的存活率。新抽出的骨髓標(biāo)本可以補(bǔ)充少量的培養(yǎng)基，并應(yīng)在室溫下儲(chǔ)存不超過(guò) 48 小時(shí)。如果標(biāo)本在較低溫度下儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間，CD138 抗原可能會(huì)脫落，CD138 強(qiáng)度及變異系數(shù)會(huì)大幅增加（如下圖）。骨髓在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格避免溫度過(guò)度變化，但室溫運(yùn)輸已被證實(shí)是可以接受的。由于標(biāo)本年齡是 MFC 分析中的一個(gè)關(guān)鍵變量，因此應(yīng)在標(biāo)本上標(biāo)注采集日期和時(shí)間并盡快處理。多中?臨床試驗(yàn)采用的標(biāo)準(zhǔn)是從標(biāo)本采集到染色不超過(guò) 24 小時(shí)。

此外，標(biāo)本質(zhì)量受損的證據(jù)包括溶血、凝塊、骨髓稀釋、標(biāo)本摸起來(lái)太冷或太熱，以及存在凋亡的漿細(xì)胞（在分析過(guò)程中檢測(cè)到前向散射和側(cè)向散射光減少）。應(yīng)評(píng)估骨髓細(xì)胞活率，如果低于 85%，則被認(rèn)為是 MM MRD 檢測(cè)的次優(yōu)選擇。只要樣本的完整性受到影響，就必須在最后的報(bào)告中注明觀(guān)察結(jié)果。

PART 2 · 方案和克隆選擇 ·

由于在治療后的骨髓穿刺物中可能存在極少量異常 PC，而且患者細(xì)胞濃度基本已經(jīng)恢復(fù)至正常水平，采集到足夠的細(xì)胞數(shù)量顯得難能可貴，ICCS（國(guó)際臨床流式協(xié)會(huì)）推薦使用一管十色方案精確評(píng)估 MM MRD，不僅大大節(jié)約了樣本，還避免多管重復(fù)設(shè)門(mén)造成技術(shù)成本上升。目前的共識(shí)建議使用CD38 和 CD138 設(shè)門(mén)圈選 PC，通過(guò)表面單克隆抗體 CD19、CD56、CD27、CD81、CD117 以及胞質(zhì)抗 Kappa 和抗 Lambda 多克隆等抗體來(lái)精確區(qū)分正常和異常 PC。

開(kāi)發(fā)或修改目前實(shí)驗(yàn)室的 MM MRD 方案，都應(yīng)該完成方法確認(rèn)才能進(jìn)行病人結(jié)果報(bào)告。適當(dāng)驗(yàn)證每個(gè)標(biāo)記物結(jié)合熒光素的分辨能力，確定抗體性能的方法是將其染色分辨率與方案中使用的所有其他抗體一起評(píng)估，而不是單獨(dú)使用該抗體，最好是通過(guò)染色指數(shù)的計(jì)算來(lái)實(shí)現(xiàn)。除了評(píng)估所使用的熒光單抗的染色指數(shù)外，還要優(yōu)化方案設(shè)計(jì)，避免選擇的熒光染料有顯著的擴(kuò)散誤差從而導(dǎo)致相關(guān)通道的分辨率下降。

需要注意的是，隨著針對(duì) MM 細(xì)胞表面抗原（如 CD38 單抗等）新藥相繼被用于臨床，這些療法可以阻斷 MM 細(xì)胞表面抗原達(dá)數(shù)月之久，因此可能對(duì)多色流式檢測(cè)產(chǎn)生干擾。Darzalex® (daratumumab)是一種抗 CD38 IgG1kappa 人單克隆抗體，以高親和力與特別的 CD38 表位結(jié)合，已被證明是治療難治性多發(fā)性骨髓瘤患者的有效藥物。daratumumab 使更多患者獲得 MRD陰性并提高了生存率。由于 CD38 是用于多色流式識(shí)別 PC 的關(guān)鍵標(biāo)識(shí)物，因此 daratumumab 的使用會(huì)影響 MM MRD 的檢測(cè)靈敏度。更不幸的是，另一個(gè)主要設(shè)門(mén)標(biāo)識(shí) CD138 可以在 PC 上異質(zhì)性表達(dá)，并在不正確的儲(chǔ)存條件和/或細(xì)胞老化時(shí)從細(xì)胞表面脫落。

目前，當(dāng) CD38 和/或 CD138 受到影響時(shí)，可以考慮替代標(biāo)識(shí)，例如：大多數(shù) PC 表達(dá)的 CD54、CD229 和 CD319。然而，這些標(biāo)記不是 PC 特異性的，所以限制了它們完整取代 CD38 和/或 CD138 來(lái)檢測(cè) PC 的可能性；CD269 的表達(dá)更具 PC 特異性，但并非所有 PC 都表達(dá)此特定標(biāo)記；EuroFlow 建議使用多表位的CD38-ME 抗體。然而，CD38-ME 抗體在 daratumumab 存在的情況下僅能部分恢復(fù) CD38 的檢測(cè)，并且強(qiáng)度仍然減弱，與未經(jīng)處理的樣品相比，熒光強(qiáng)度損失超過(guò) 50%；VS38c 是一種能識(shí)別內(nèi)質(zhì)網(wǎng) CLIMP-63 蛋白的小鼠mAb，使用 VS38c 是基于假設(shè)腫瘤性 PC 由于分泌能力增強(qiáng)，故以遠(yuǎn)高于正常PC 和其他白細(xì)胞亞群的水平表達(dá) CLIMP-63。但有研究已經(jīng)表明，雖然 VS38c在大多數(shù) PC 中高度表達(dá)，但它也由其他造血細(xì)胞表達(dá)，包括單核細(xì)胞、髓系細(xì)胞和 B 細(xì)胞亞群。另外，VS38c 需要破膜檢測(cè)，對(duì)破膜劑要求較高，細(xì)胞不進(jìn)行預(yù)洗滌也會(huì)影響結(jié)果（如下圖）。選擇 Perfix-NC 使用一步法對(duì) PC 進(jìn)行固定破膜和染色，可以有效減少處理步驟繁瑣導(dǎo)致自發(fā)熒光增加，而且大大縮減了樣本制備時(shí)間。

目前能夠克服這些克隆的弊端的一種策略是使用 CD38 納米抗體（CD38nano,克隆 JK36）對(duì) PC 進(jìn)行染色，納米抗體是單可變結(jié)構(gòu)域抗體片段（VHH），通常會(huì)暴露較長(zhǎng)的互補(bǔ)決定區(qū) 3（CDR3），該特性使抗 CD38nano 能夠識(shí)別抗 CD38 療法無(wú)法掩蓋的隱秘表位。

PART 3 · 樣品處理方法 ·

目前的共識(shí)建議是每管至少采集 2×10E6 個(gè)細(xì)胞，最好是 5×10E6 個(gè)細(xì)胞，還建議使用“預(yù)裂解"的染色程序來(lái)獲得 MRD 評(píng)估所需的大量細(xì)胞，同時(shí)承認(rèn)其他染色程序經(jīng)過(guò)適當(dāng)驗(yàn)證后也可使用。

在“預(yù)裂解"程序中，大量骨髓樣品在染色之前先用大體積裂解液裂解，接著染色標(biāo)記，在上機(jī)之前，再次裂解以去除殘留的紅細(xì)胞。但習(xí)慣了“染色后裂解"的實(shí)驗(yàn)室使用該方法可能比較難轉(zhuǎn)換過(guò)來(lái)。此外，兩次裂解可能會(huì)影響某些抗原的染色強(qiáng)度（如下圖），或?qū)е履承┐?lián)染料的分解。

另一種替代方法是使用“混合管"方法。這種方法是將骨髓樣本按照常規(guī)程序（先染色后裂解）處理后，最后混在一起增加可獲取的細(xì)胞總數(shù)。使用“混合管"方法的優(yōu)點(diǎn)是和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作步驟一致，更容易接納。此外，該方法只裂解一次，故可更好地保留抗原表達(dá)。

另外，自動(dòng)化的流式樣本制備可以標(biāo)準(zhǔn)化，提升效率和結(jié)果準(zhǔn)確性，也是一種值得推薦的方法。流式樣本制備允許一次性移液 400uL 骨髓樣本進(jìn)行抗體染色，支持“預(yù)裂解"和“染色后裂解"等方法，并可以機(jī)載完成細(xì)胞預(yù)洗滌、溶血后洗滌和固定破膜等程序。利用流式樣本制備進(jìn)行MM MRD 樣本制備，結(jié)果表明：相較于免洗方法檢測(cè)骨髓 PC，細(xì)胞得率并沒(méi)有受到樣本預(yù)洗滌和破膜等流程的影響，且 PC 比例沒(méi)有明顯變化（如下圖）。

無(wú)論如何都不能使用 Ficoll 富集細(xì)胞，因?yàn)楦患^(guò)程會(huì)導(dǎo)致 PC 的選擇性丟失并影響一些抗原表達(dá)（例如 CD138）。

PART 4 · 檢測(cè)限和定量下限 ·

在大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室中，MFC 識(shí)別骨髓中腫瘤性 PC 的檢測(cè)靈敏度范圍為 10E-4（萬(wàn)分之一）到 10E-6（百萬(wàn)分之一）。盡管多中心數(shù)據(jù)已證明 0.01%的檢測(cè)靈敏度對(duì) MRD 評(píng)估具有明確的預(yù)后價(jià)值，但很明顯，隨著檢測(cè)靈敏度的提高，MRD 狀態(tài)與臨床結(jié)果之間的相關(guān)性也在增加。

為了建立測(cè)定和/或儀器的檢測(cè)靈敏度以從背景中枚舉少量真實(shí) PC，需要建立空白限（LOB）、檢測(cè)限（LOD）和定量下限（LLOQ）。

LOB 被定義為在沒(méi)有漿細(xì)胞的樣本中，MRD 最終設(shè)門(mén)區(qū)域能檢測(cè)到的背景事件數(shù)量或百分比，因?yàn)橐阎蠖鄶?shù)骨髓至少含有一定水平的漿細(xì)胞，所以使用骨髓樣本染上 MM MRD 方案中所有的抗體（除了 CD38 和 CD138 以外），就能完成 LOB 的建立。

LOD 則被定義為可靠地區(qū)分高于 LOB 水平的漿細(xì)胞的能力，在此水平，99%以上的具有低水平 PC 的樣品將被檢測(cè)出來(lái)，其計(jì)算方法是 LOB 平均值加上 3 倍 LOB 測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

LLOQ 被定義為在某些預(yù)定義的偏倚和不精密度下，可以在LOB以上可重復(fù)檢測(cè)到的PC的最少數(shù)量或百分比。臨床普遍認(rèn)為MRD檢測(cè)的不精密度（變異系數(shù)）不應(yīng)超過(guò)30%。

其他研究表明，20 個(gè)事件是 LOD 理論上的保守閾值。共識(shí)指南建議 MMMRD 的 LOD 至少為 0.001%，這意味著最少收集 2×10E6 個(gè)事件進(jìn)行分析。如果采集的細(xì)胞數(shù)量少于 200 萬(wàn)且未檢測(cè)到 MRD，則應(yīng)對(duì) LOD 進(jìn)行說(shuō)明，并在報(bào)告中說(shuō)明分析靈敏度降低的限定性聲明。同樣，通常使用 50 個(gè)事件來(lái)表示LLOQ 閾值，因此，總事件數(shù)為 5×10E6 才能達(dá)到 0.001%的 LLOQ。盡管如此，根據(jù)美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)的建議，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)憑經(jīng)驗(yàn)確認(rèn)其 LOD 和 LLOQ。LLOQ 的最佳確定方法是，使用接近 LOD 的至少三種不同濃度樣品重復(fù) 3-5 次對(duì)異常 PC 進(jìn)行計(jì)數(shù)。確定 LLOQ 的一種實(shí)用方法是將患有漿細(xì)胞疾病的骨髓樣本按照 MM MRD 方案進(jìn)行全染色，用部分染色的健康樣本進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋?zhuān)玫降蜐舛葮颖尽?/p>

PART 5 · 數(shù)據(jù)分析和報(bào)告 ·

MRD 數(shù)據(jù)的分析在很大程度上取決于分析人員定義正常與異常 PC 的專(zhuān)業(yè)知識(shí)水平。作為標(biāo)準(zhǔn)做法，理想的數(shù)據(jù)分析工作流程應(yīng)從 Time 參數(shù)開(kāi)始，以排除無(wú)效事件，例如氣泡或堵塞。FSC-A、W、H 的組合用于排除粘連體。但是，在評(píng)估 PC 時(shí)應(yīng)格外小心，因?yàn)樗鼈兊?FSC 和 SSC 可能很難固定，不同患者之間可能相差很大。Sidana 及其同事在一項(xiàng)前瞻性研究中表明，根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估，275 名新診斷的 MM 患者中有 17 名（6%）是四倍體，這些四倍體群體通常表現(xiàn)出高于正常細(xì)胞群體的異常光散射特征，由于其較高的散射光信號(hào)，這些細(xì)胞很可能落入散點(diǎn)圖的“粘連體"區(qū)域。出于這個(gè)原因，當(dāng)使用前向和側(cè)向散射光信號(hào)來(lái)排除粘連體時(shí)，應(yīng)注意不要排除這個(gè)群體。圈出總漿細(xì)胞的完整設(shè)門(mén)策略見(jiàn)下圖：

如果漿細(xì)胞表達(dá)異?？乖蛘弑憩F(xiàn)出正?？乖谋磉_(dá)水平增加或減少，則通常認(rèn)為漿細(xì)胞是異常的。目前的共識(shí)是用 CD38、CD138、CD45 和光散射特征的組合識(shí)別 PC，為了準(zhǔn)確區(qū)分骨髓瘤細(xì)胞與正常 PC，方案中應(yīng)包括CD38、CD45、CD19、CD56、CD81、CD117 和胞內(nèi)輕鏈。正常 PC 通常表達(dá)為 CD38bright、CD45+、CD19+、CD56?、CD27bright、CD81bright 和 CD117?且無(wú)輕鏈限制性。異常 PC 通常會(huì)有 2 個(gè)或更多標(biāo)識(shí)的異常表達(dá)。例如，腫瘤PC 出現(xiàn) CD38 減弱和 CD45 缺失，CD19-、CD56+/bright、CD27dim、CD81dim 和輕鏈限制性表達(dá)可用于識(shí)別異常 PC。

當(dāng)前挑戰(zhàn)

由于流式 MM MRD 檢測(cè)已成為確定新療法療效和患者反應(yīng)深度的重要方法，因此需要一種共識(shí)方法，以便可以解釋獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室之間的測(cè)試結(jié)果可重復(fù)性和意義。2013 年對(duì)美國(guó)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行骨髓瘤流式 MRD 的一項(xiàng)調(diào)查表明，流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方法導(dǎo)致 MM MRD 分析和解釋存在重大差異。從那時(shí)起，一系列努力使這些方面標(biāo)準(zhǔn)化，例如，英國(guó)國(guó)家外部質(zhì)量評(píng)估服務(wù)中心（UK NEQAS）最近倡導(dǎo)了一個(gè)外部質(zhì)量評(píng)估計(jì)劃，該計(jì)劃評(píng)估了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) MM MRD 的可重復(fù)性。在這項(xiàng)研究中，將含有 0%、0.1%、0.01%、0.001%和 0.0001%的5個(gè)稀釋系列的骨髓樣本分發(fā)給 10 個(gè)國(guó)際實(shí)驗(yàn)室，其中 8 個(gè)實(shí)驗(yàn)室提交了答復(fù)。這些實(shí)驗(yàn)室被要求使用他們自己實(shí)驗(yàn)室建立的程序?qū)?xì)胞進(jìn)行染色，并根據(jù) MM MRD 測(cè)試的樣本染色、采集、分析和報(bào)告的共識(shí)指南對(duì)骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行定量評(píng)估?？傮w而言，該研究證明了低至0.001%的 MRD 水平還存在良好的檢測(cè)線(xiàn)性，8個(gè)實(shí)驗(yàn)室中有6個(gè)檢測(cè)到腫瘤PC 的最少限水平為0.0001%。然而，在方案設(shè)計(jì)、熒光染料偶聯(lián)物和使用的裂解試劑中發(fā)現(xiàn)了偏差。該研究得出的結(jié)論是，如果MFC對(duì)MM MRD的評(píng)估進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化，也可以減少實(shí)驗(yàn)室間的差異。

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